В об’єднанні православної й католицької церков були зацікавлені польський король — для остаточного ополячення українців і білорусів, Папа Римський — для збільшення своїх володінь і доходів, православні ієрархи — для зрівняння в правах з католицькими. У 1596 р. в Бересті була проголошена церковна унія — об’єднання православної церкви з католицькою, унаслідок чого утворилася нова — уніатська церква (греко-католицька).
Основні умови Берестейської унії
• Прийняття католицької догматики про чистилище, походження Духа Святого від Бога-Отця та Бога-Сина.
• Визнання зверхності Папи Римського як першоієрарха всієї християнської церкви.
• Збереження православної візантійської обрядовості та юліанського календаря.
• Проведення богослужінь церковнослов’янською мовою.
• Виборне право на заміщення митрополичної та єпископської кафедр із наступним затвердженням обраних духовних осіб світською владою.
• Збереження за нижчим духовенством права одружуватися, на відміну від обов’язкової безшлюбності латинського духовенства.
• Підтвердження східних принципів організації чернечого життя.
• Зрівняння у правах руського духовенства з латинським у Речі Посполитій: звільнення від сплати податків, право займати державні посади, надання єпископам прав сенаторів.
• Навчання у школах і семінаріях на україно-білоруських землях повинно проводитися грецькою та слов’янською мовами.
• Підпорядкування братств єпископам.
Діяльність православної церкви в Peчi Посполитій було заборонено, закривалися православні храми та парафіяльні школи, що діяли при них, православні монастирі та церкви передавалися католикам або уніатам (греко-католикам), ченці та священики зазнавали переслідувань з боку польської шляхти. Фактично відбулося не рівноправне об’єднання церков, а підкорення православ’я католицизму. Проти церковної унії виступили народні маси, частина знаті на чолі з князем Василем Костянтином Острозьким (1527—1608 рр.), братства (громадські організації міщан, створені для захисту православної пастви). Це змусило Польщу в 1632 р. знову дозволити легальне існування православної церкви.
Отже, релігійна ситуація в Україні наприкінці XVI — у першій половині XVII ст. була складною і драматичною. Як у Західній Європі в XVI ст. від католицизму відокремився протестантизм, так в Україні й Білорусії від православної церкви відокремилася греко-католицька.