У 1591 р. гетьман реєстрових козаків К. Косинський, а з ним козаки й селяни, на Волині, Брацлавщині та Київщині почали мститись панам за численні кривди. Повстання було придушене тільки у 1593 р., та покарали повсталих надзвичайно легко, видно побоюючись – щоб не спровокувати нового бунту.
У 1595 р. спалахнуло повстання С. Наливайка, яке охопило Київщину, Брацлавщину, Галичину, Волинь та Білорусь. Бунтівників підтримали загони козацьких ватажків М. Шаули та Г. Лободи. Проте навесні 1596 р., коли повстанці потерпали від голоду, хвороб і втрат живої сили, козацька старшина нишком видала Наливайка полякам, а повстанців переконала скласти зброю. Сталося це в урочищі Солониця, неподалік від Лубен.
Найвизначнішим козацьким гетьманом у період до Богдана Хмельницького був П. Конашевич-Сагайдачний (1614–1622). Уславився він тім, що очолив кілька вдалих походів на Оттоманську Порту і Кримське ханство. З ім’ям гетьмана пов’язане взяття Варни (1606) і Кафи (1616). У 1618 р. він взяв участь у поході військ польського королевича Владислава на Москву. У своїй діяльності керувався прагматизмом, тверезим розрахунком, твердістю і водночас схильністю до компромісів.
Переконаний, що козаки поступаються силою Речі Посполитій, Сагайдачний стримував антипольські повстання, натомість дбав про зміцнення українства. Наприклад, у 1619 р. з тактичних міркувань він погодився на принизливі польські вимоги скоротити реєстр до 3000 осіб, на призначення старшини королем, припинення самостійних виходів у море. Але під прикриттям цього договору в наступному році гетьман добився відновлення православної ієрархії в Речі Посполитій, висвячення на митрополита І. Борецького, трьох єпископів. За пропозицією Сагайдачного весь Запорозький Кіш вступив до Київського братства, тим самим військова сила козацтва була об’єднана з політично слабкою церковною й культурною верхівкою України, тобто відбулося гуртування усіх верств суспільства навколо козацтва. У 1621 р. у битві під Хотином з військами Османської імперії Сагайдачний був тяжко поранений і в наступному році помер.
Після його смерті знов вибухають повстання (1630 р. – під проводом Т. Федоровича, прозваного Трясилом, 1635 р. – І. Сулими, 1637–1638 рр. – П. Павлюка, Я. Острянина та Д. Гуні). Придушивши ці повстання, Польща відповіла жорстокими репресивними заходами, в числі яких були зменшення реєстру, заборона козацького самоврядування, проголошення козаків, не вписаних у реєстр, кріпаками. Гетьмана мав заступити обраний сеймом комісар, який зосереджував у своїх руках усю повноту влади над реєстровиками. Запобігати втечам на Низ (вони прирівнювались до злочину) мала відбудована 1639 р. Кодацька фортеця. Саме Запорожжя контролював розміщений там постійний польський гарнізон.